Imagerie de la dynamique calcique dans les cellules ciliées de la ligne latérale des larves de poisson-zèbre

Résumé

Source : Lukasz, D., et al. Imagerie calcique in vivo des cellules ciliées de la ligne latérale chez les larves de poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre l’imagerie en direct de l’afflux de calcium dans les cellules ciliées de la ligne latérale d’une larve de poisson-zèbre transgénique paralysée à l’aide d’un microscope confocal. La stimulation mécanique des faisceaux de cheveux par des impulsions fluides induit l’entrée du calcium par les canaux de mécanotransduction et les canaux voltage-dépendants, ce qui est visualisé en temps réel à l’aide d’indicateurs de fluorescence. La méthode met en évidence la dynamique calcique apicale et basale dans les cellules ciliées des neuromastères, élucidant leur rôle dans la détection des mouvements de l’eau.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Épinglage et immobilisation de la larve dans la chambre d’imagerie
   1. Baignez une larve Tg(myo6b :GCaMP6s-caax) dans environ 1 mL de tampon embryonnaire (E3) contenant 0,04 % de MS-222 pendant 1 à 2 min sur la surface de l’encapsulant en silicone de la chambre d’imagerie jusqu’à ce que la larve devienne immobile ou insensible au toucher.
      1. À l’aide d’un stéréomicroscope, placez la larve au centre de la chambre de perfusion de manière à ce qu’elle repose à plat sur le côté contre l’encapsulant en silicone.
         REMARQUE : Pour plus d’uniformité, montez toujours les larves du même côté (p. ex., côté droit vers le bas, côté gauche vers le haut) (figure 2B1).
   2. À l’aide d’une pince fine, abaissez une goupille de tête de 0,035 mm perpendiculairement à la larve et à la chambre. Insérez l’épingle de tête entre l’œil et la vésicule otique et descendez dans l’encapsulant (figures 1B1 et 1B2). Utilisez une deuxième paire de pinces pour stabiliser la larve le long de sa face dorsale ou ventrale pendant l’épinglage. Assurez-vous que la partie horizontale de la goupille entre en contact avec la larve et n’appuie pas complètement sur l’encapsulant. Inclinez la broche ventralement (figure 1B1) ou pointez légèrement vers l’avant du poisson pour éviter d’interférer avec l’injection cardiaque ultérieure et l’imagerie des cellules ciliées.
      1. À l’aide de la pince, insérez une goupille de queue de 0,025 mm dans la notocorde aussi près que possible de l’extrémité de la queue (Figure 1B1).
         REMARQUE : Veillez à ne pas étirer la larve. Épinglez la larve à plat. Les yeux doivent être superposés (Figure 2B1). Ceci est très important pour faciliter l’injection cardiaque (Figure 1B2-B2', étape 3), faciliter un plan d’imagerie souhaitable (Figure 1B1-B2'', étape 5) et quantifier l’intensité du stimulus de jet de fluide (Figure 3A3, étape 4).
2. Injection de α-Bungarotoxine dans la cavité cardiaque pour paralyser la larve

REMARQUE : Portez des gants lors de la manipulation de la α-bungarotoxine.

1. Centrifuge brièvement l’aliquote de α-bungarotoxine avant utilisation pour éviter l’obstruction de l’aiguille d’injection cardiaque.
   1. Remplissez 3 μL de solution de α-bungarotoxine dans une aiguille d’injection cardiaque à l’aide d’une pointe de pipette de chargement de gel. Chargez la solution uniformément jusqu’à l’extrémité sans bulles.
   2. Insérez l’aiguille d’injection en forme de cœur dans un porte-pipette fixé à un micromanipulateur manuel. Sous un stéréomicroscope, positionnez l’aiguille de manière à ce qu’elle soit alignée perpendiculairement à l’axe A-P des larves épinglées et anesthésiées, en pointant vers le bas à un angle de ~30°.
   3. Connectez le support de pipette à l’injecteur de pression. Appliquez les paramètres suggérés suivants : Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s et Pcompensation = 5 hPa. Injectez un bolus dans la solution pour vérifier si la pointe de l’aiguille est perméable.
   4. Cherchez une petite bouffée de solution rouge (de rouge de phénol) pour laisser la pointe de l’aiguille. Si aucune couleur rouge n’est visible, grattez très doucement la pointe de l’aiguille contre le bord d’une épingle et réessayez jusqu’à ce que l’aiguille soit vernie. Vous pouvez également tirer sur une aiguille avec une ouverture de pointe plus grande.
2. Avancez l’aiguille vers le cœur jusqu’à ce qu’elle touche la peau à l’extérieur du cœur (Figure 1B2). Enfoncez l’aiguille dans la larve et recherchez l’indentation de la cellule pigmentaire sur la peau devant le cœur pour vous assurer que l’aiguille est positionnée dans le bon plan par rapport à la larve (figure 1B2').
   1. Avancez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle perce la peau et pénètre dans la cavité cardiaque. Tirez légèrement l’aiguille vers l’arrière. Injectez un bolus de α-bondarotoxine dans la cavité cardiaque. Recherchez le gonflement de la cavité cardiaque ou un colorant rouge pénétrant dans la cavité.
3. Rincer doucement la larve 3 fois avec 1 mL de tampon neuronal (NB) pour éliminer les résidus de MS-222. Ne retirez jamais tout le liquide. Maintenir la larve dans environ 1 mL de NB sur la chambre de perfusion.
   REMARQUE : S’assurer que le rythme cardiaque et le flux sanguin des larves restent robustes après l’épinglage et l’injection cardiaque et tout au long de l’expérience d’imagerie.
4. Préparation du microscope et de la configuration du jet de fluide
   1. Assemblez un microscope confocal droit en utilisant les composants décrits dans le Tableau des matériaux : un microscope confocal avec un laser de 488 nm et des filtres appropriés, un logiciel de microscope pour contrôler et coordonner l’imagerie et la stimulation, un objectif 10x air, un objectif 60x eau, un scanner d’objectif piézo-Z (pour les z-stacks), une caméra haute vitesse, une chambre circulaire adaptateur, platine motorisée et adaptateur d’insert de scène.
   2. Assemblez le jet de fluide composé de 3 composants principaux : une pompe à vide et à pression, une pince de pression à grande vitesse et un étage de tête (également décrit dans la Table des matériaux). Utilisez la pince à pression haute vitesse pour contrôler le moment et la durée de la décharge de pression ou de vide hors de l’étage des têtes et dans la pipette à jet de fluide.
      1. Connectez la sortie de l’étage de tête au support de pipette à jet de fluide via un tube en silicone à paroi épaisse.
5. Alignement de la larve et du jet de fluide

REMARQUE : Il y a 3 plans d’intérêt à l’intérieur de chaque neuromaste : (1) les pointes des faisceaux pileux (Figure 3A3 : les kinociliums, utilisés pour mesurer l’intensité du stimulus) ; (2) le plan de mécanotransduction du faisceau pileux (MET) (Figure 2B1-B1' : la base des faisceaux pileux apicaux où les signaux calciques dépendants du canal MET sont détectés) ; et (3) le plan synaptique (Figure 2B2-B2' : où les signaux calciques présynaptiques sont détectés à la base de la cellule ciliée). Ces plans sont décrits à la figure 2A.

1. Remplissez 10 μL de NB dans une aiguille à jet de fluide correctement cassée à l’aide d’une pointe de chargement de gel. Chargez la solution uniformément jusqu’à l’extrémité sans bulles. Insérez l’aiguille dans le porte-pipette fixé au micromanipulateur motorisé.
2. Placez la chambre de perfusion dans un adaptateur de chambre circulaire sur la platine du microscope. note: Pour plus d’uniformité, positionnez toujours la larve dans la même orientation (par exemple, la chambre contenant la larve avec son postérieur vers le jet de fluide et sa face ventrale tournée vers l’expérimentateur).
   1. Déplace la platine motorisée de manière à ce que la larve soit au centre du champ de vision. Tournez l’adaptateur de chambre circulaire de manière à ce que l’axe antéropostérieur (A-P) de la larve soit à peu près aligné avec la trajectoire de l’aiguille à jet de fluide.
   2. À l’aide de la lumière transmise et du contraste interférentiel différentiel (DIC), faites la mise au point sur la larve et centrez-la sous l’objectif 10x. Augmentez l’objectif 10x.
3. À l’aide du micromanipulateur motorisé, abaissez l’aiguille du jet de fluide au centre du champ de vision afin qu’elle soit éclairée par la lumière transmise et qu’elle touche à peine la solution NB.
   1. Baisse l’objectif 10x. Concentrez-vous sur la larve pour confirmer sa localisation. Concentrez-vous vers le haut pour trouver l’aiguille à jet de fluide. Déplacez l’aiguille à jet de fluide avec le micromanipulateur dans les axes x et y jusqu’à ce qu’elle soit dans une position parallèle à la face dorsale du poisson.
   2. Revenons à la larve. Abaissez l’aiguille dans l’axe z. Placez l’aiguille le long de la face dorsale du poisson et à ~1 mm du corps (figure 3A1).
   3. Déplacez avec précaution l’adaptateur de la chambre circulaire (si nécessaire) pour vous assurer que l’aiguille du jet de fluide est alignée le long de la ligne médiane A-P de la larve (figure 3A1).
   4. Déplacez la platine motorisée pour placer le neuromaste d’intérêt au centre du champ de vision. Gardez la pointe de l’aiguille à jet de fluide le long de la face dorsale du poisson. Ne touchez pas la pointe de l’aiguille de jet de fluide à la larve ou à la surface de la chambre.
4. Passez à l’objectif d’eau 60x. Assurez-vous que l’objectif est immergé dans la solution NB. Utilisez la mise au point fine pour localiser un neuromaste à l’aide de la lumière transmise et de l’optique DIC.
   REMARQUE : Cette configuration est conçue pour stimuler les neuromastes le long de la ligne latérale postérieure primaire. Les cellules ciliées de ces neuromastes réagissent à un flux de fluide dirigé vers l’avant ou vers l’arrière.
   1. Positionnez l’aiguille à jet de fluide avec le micromanipulateur de manière à ce qu’elle soit à 100 μm du bord extérieur du neuromaste (Figure 3A2).
      REMARQUE : Choisissez des neuromastes qui offrent des vues claires de haut en bas (Figures 2B1'-B2' et Figure 3A3) plutôt que des vues inclinées latérales (Figure 2C1-C2). Une vue claire de haut en bas permet d’imager simultanément tous les faisceaux de poils apicaux dans un seul plan optique ou d’imager les zones synaptiques dans moins de plans optiques (Figure 3A3).
   2. Concentrez-vous jusqu’à l’extrémité des faisceaux de poils apicaux (kinocilias) (Figure 1A, Figures 3A2 et 3A3). Le bas de l’aiguille à jet de fluide doit être net dans ce plan.
5. Réglez la pince de pression à grande vitesse du mode manuel au mode externe pour recevoir les données du logiciel d’imagerie.
   1. Zéro la pince de pression à grande vitesse en appuyant sur le bouton « zéro ». À l’aide du bouton de consigne, réglez la pression de repos légèrement positive (~2 mmHg). Confirmez la sortie de repos de la pince à pression à grande vitesse à l’aide d’un manomètre en livres par pouce carré (PSI) fixé à la sortie de l’étage de tête.
      REMARQUE : Réglez une pression légèrement positive au repos pour éviter l’absorption progressive du fluide dans l’aiguille à jet de fluide au fil du temps. Si le fluide pénètre dans le tube relié au jet de fluide et atteint la tête d’eau, il peut endommager l’équipement.
   2. Déterminez la pression nécessaire pour stimuler les faisceaux de cheveux. Utilisez une entrée de 0,125 et 0,25 V (6,25 et 12,5 mmHg) pendant 200 à 500 ms pour appliquer un stimulus de test (Figure 3A3-A3'').
      REMARQUE : La pince de pression à grande vitesse convertit une entrée de tension (provenant d’un logiciel ou d’autres dispositifs qui se connectent au port BNC (Bayonet Neill-Concelman) sur le port de commande de la pince de pression à grande vitesse) en pression qui est évacuée de l’étage de tête, et enfin, l’aiguille à jet de fluide (1,0 V = 50 mmHg, tandis que -1,0 V = -50 mmHg). Dans cette configuration (voir étape 4.2), la pression positive (poussée) dévie les faisceaux de cheveux vers l’avant, et la pression négative (traction) dévie les faisceaux de cheveux vers l’arrière.
   3. À l’aide de la lumière transmise et de l’optique DIC ainsi que d’une barre d’échelle, mesurez la distance de déviation par les stimuli de 6,25 et 12,5 mmHg des pointes des faisceaux de cheveux, les kinocilia (Figure 2A et Figures 3A3-3''). Choisissez une pression qui déplace les faisceaux (en tant qu’unité 1 unité cohésive) sur une distance d’environ 5 μm (Figure 3A3''). Assurez-vous que les pointes du kinocilia restent nettes tout le temps.
   4. Déplacez le jet de fluide ± 25 μm le long de l’axe A-P de la larve pour trouver une distance et une pression qui dévient les extrémités des kinocilia de 5 μm.
      REMARQUE : En utilisant des GCaMP6 chez les larves 3 à 7 jours après la fécondation (dpf), une déviation de 5 μm devrait permettre d’obtenir des signaux calciques GCaMP6s presque saturés et ne devrait pas endommager les structures apicales des faisceaux de poils (Figure 3A3''). Des distances de déplacement plus petites peuvent être utilisées pour délivrer des stimuli non saturants (Figure 3A3'). Les distances de déplacement >10 μm sont difficiles à estimer (Figure 3A3''') et peuvent être dommageables au fil du temps. La saturation du signal dépend de l’âge du neuromaste (et de la hauteur kinociliale) ainsi que de l’indicateur utilisé. Vérifiez périodiquement la perméabilité de l’aiguille du jet de fluide dans chaque direction (pression/poussée et vide/traction) pendant l’imagerie. Les aiguilles à jet de fluide se bouchent facilement et perdent leur perméabilité sous vide, mais elles conservent la perméabilité de la pression résiduelle. Utilisez une optique DIC et un court stimulus de test dans chaque direction pour vérifier la perméabilité du jet de fluide.
   5. Focalisez l’échantillon dans le plan d’intérêt (par exemple, la base des faisceaux pileux apicaux ou la base de la cellule ciliée dans le plan synaptique ; Figures 2B1-B2').
6. Procédure d’acquisition d’images : Acquisition sur un seul plan

REMARQUE : Toutes les images décrites dans ce protocole sont effectuées à température ambiante (RT).

1. Configurez le logiciel d’imagerie pour qu’il acquière une acquisition en continu ou en continu de 80 images avec une capture toutes les 100 ms afin d’atteindre une fréquence d’images de 10 Hz.
2. Réglez le gain, l’ouverture et la puissance laser pour optimiser la détection du signal, mais évitez la saturation, le photoblanchiment et le bruit. Des exemples de paramètres pour un Opterra/SFC sont les suivants : Puissance laser 488 nm : 50 (plan MET du faisceau de cheveux), 75 (plan synaptique) ; Fente de 35 μm ; gain = 2,7 ; Gain EM = 3900.
   REMARQUE : Appliquez 2 fois le binning si les signaux sont trop faibles ou bruyants ou s’ils ont un photoblanchiment excessif. Le binning 2 X améliorera la détection du signal au détriment de la résolution spatiale.
3. Sélectionner un stimulus à délivrer lors de l’acquisition de 80 images (8 s) après l’image 30, à 3 s.
   REMARQUE : Voici quelques exemples de stimuli : 200 ms (+ ou - 0,25 V) jusqu’à 2 s (+ ou - 0,25 V) dans la direction antérieure ou postérieure pour identifier la sensibilité directionnelle de chaque cellule ciliée ; 2 s, Onde carrée 5 Hz (0,25 V pendant 200 ms, -0,25 V pendant 200 ms, répétée 5 fois) pour stimuler toutes les cellules ciliées simultanément. Une pression positive (stimulus antérieur) activera la moitié des cellules ciliées. Une pression négative (stimulus postérieur) activera l’autre moitié des cellules ciliées. Assurez-vous que le logiciel ou l’appareil de stimulation ramène la pince de pression à 0 V une fois le stimulus terminé.
4. Mesurer les réponses calciques mécanosensibles. Concentrez-vous sur la base des faisceaux de poils apicaux (Figures 2A et 2B1-B1') et commencez l’acquisition d’images.
   REMARQUE : Si le neuromaste est clairement vu de haut en bas (Figure 2B1-B1'), tous les faisceaux de poils apicaux peuvent être imagés simultanément dans un seul plan.
5. Mesurer les réponses calciques présynaptiques. Concentrez-vous sur la base des cellules ciliées (figures 2A et 2B2-B2') et lancez l’acquisition de l’image.
   REMARQUE : Si le neuromaste est clairement vu de haut en bas (figure 2B2-B2'), les plans d’imagerie présynaptique de toutes les cellules ciliées peuvent être acquis dans 2 à 3 plans distants de 2 μm. Les poissons transgéniques Tg[myo6b :faux-filet-cerisier] peuvent être utilisés pour identifier et localiser les rubans présynaptiques et les sites d’entrée du calcium.

Résultats

Figure 1 : Chambre d’imagerie, procédures de montage et d’injection de cœur de poisson-zèbre, et aiguilles. (A) On voit une chambre d’imagerie avec une larve (délimitée par un rectangle en pointillés) épinglée au centre au-dessus de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Pour paralyser les larves avant l’imagerie
Chambre d’imagerie	Siskiyou	PC-R Plate-forme	pour monter les larves pour l’imagerie
N° 1.5 Lamelles carrées, 22*22 mm	VWR	48366-227	Pour sceller la chambre d’imagerie
Graisse silicone sous vide poussé	Fischer Scientific	14-635-5D	Pour la fixation de lamelle sur la chambre d’imagerie
Encapsulant silicone transparent 0,5 g kit	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5KG	Pour remplir la chambre d’imagerie afin de créer une surface pour épingler les poissons
Stéréomicroscope	Carl Zeiss Microscopie	Stemi 2000 avec éclairage à lumière transmise	Pour éclairer le fil, les pinces et les ciseaux pour faire des épingles
Pince fine	Outils de science	fine Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) N° d’article 11295-10	Pour la fabrication d’épingles
Ciseaux fins	Cole-Palmer	5.5", EW-10818-00	Pour couper le fil de tunsgten pour faire des épingles
Fil de tungstène, 0,035 mm	Goodfellow	W005131	Pour les épingles à tête pour immobiliser les larves
Fil de tungstène, 0,025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Pour les broches de queue pour immobiliser les larves
Capillaires en verre borosilicaté sans filament	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Verre à tirer dans des aiguilles à jet de fluide pour stimuler les cellules ciliées
Pinces fines	Outils de science	fine Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Réf. 11295-10	Pour épingler les larves
Gel conseils de chargement	Eppendorf	5242956003	Pour le remplissage des aiguilles d’injection cardiaque
Stéréomicroscope	Carl Zeiss Microscopie	Stemi 2000 avec éclairage en lumière transmise	Pour éclairer les larves lors de l’épinglage et de l’injection cardiaque
Porte-capillaire/aiguille en verre	WPI	MPH315	Pour tenir les aiguilles à jet de fluide
Micromanipulateur manuel	Narishige	M-152	Pour le maintien et le positionnement du porte-aiguille pour l’injection de α-bungarotoxine
Support magnétique	Narishige	GJ-1	Pour tenir le micromanipulateur manuel pour l’injection de α-bungarotoxine
Injecteur de pression	Eppendorf	Femtojet 4x	Pour administrer la α-bungarotoxine
Microscope confocal	Bruker	Swept	field/OpterraMicroscope fixe et droit avec optique DIC et laser 488 nm avec filtres appropriés
Logiciel de microscope	Bruker	Prairieview 5.3	Pour coordonner et contrôler le microscope, les lasers, la platine, le piézo-z, les caméras et l’objectif
à jet de fluide 10x	Nikon	MRH00101	Faible grossissement pour le positionnement des larves et objectif à jet de fluide
60x	Nikon	MRF07620	Objectif immergé dans l’eau avec ouverture numérique élevée (1,0) et distance de travail adéquate (2,0 mm)
Scanner d’objectif piézo-Z avec contrôleur/pilote	Instruments Physik Intruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Acquisition z-stack haute vitesse avec une précision de 0,025 um
Caméra EMCCD	QImaging	Rolera EM-C2 Caméra EMCCD	Caméra avec petite taille de pixel pouvant acquérir jusqu’à 100 images par s
Adaptateur	de chambre circulaireSiskiyou	PC-A	Pour le maintien et la rotation de la chambre d’imagerie sur
platine de microscope Platine motorisée à pont Z	Prior Scientific	ZDN12MP	Platine de microscope capable de contenir et de déplacer l’échantillon et le micromanipulateur avec aiguille à jet de fluide ensemble Adaptateur d’insertion
de platine en Z	NIH Atelier d’usinage personnalisé		Pour monter l’adaptateur de chambre circulaire sur la platine à pont en
Z Appareil	à jet de fluideALA scientific instruments	HSPC-1 Pince à pression haute vitesse avec PV-PUMP	Pour contrôler et administrer le stimulus de jet de fluide
Tube en silicone durci au peroxyde Masterflex (1 ft)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Pour connecter le porte-aiguille à jet de fluide à la pompe à pression
Micromanipulateur motorisé	Sutter Instrument Company	MP-225	Pour tenir et positionner le porte-aiguille pour fluide jet
Contrôleur de micromanipulateur	Sutter Instrument Company	MPC-200	Pour la commande d’un manipulateur d’aiguilles à jet de fluide
Conseils de chargement de gel	Eppendorf	5242956003	Pour le remplissage d’aiguilles à jet de fluide
Porte-capillaire/aiguille en verre	WPI	MPH315	Pour tenir des aiguilles à jet de fluide
Manomètre PSI	Sper Scientific	840081	Pour mesurer sortie de pince de pression
Prism7	Graphpad	Prism7	Logiciel pour tracer les changements d’intensité du GCaMP6
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/ Logiciel pour traiter les images et créer des cartes de signaux spatio-temporelles Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29
		http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin pour enregistrer les séquences d’images GCaMP6 dans FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin pour enregistrer les séquences d’images GCaMP6 dans FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin pour créer plusieurs ROI afin de mesurer les changements d’intensité du GCaMP6

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